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COPAS流式分選系統簡介及其在藥物篩選方面的應用

時間:2017-03-01來源:本站作者:玉研儀器

COPAS 流式分選系統

微型模式動物、模式植物種子、大體積細胞及微球的分選在生命科學研究中有著非常廣泛的應用,但是由于這些對象體積太大,普通流式細胞儀難以對其進行分選,而手工鏡下分選耗時耗力、效率低下、準確性難以保證,因此一種自動化大體積微粒分選系統應運而生,它就是本文介紹COPASTM多參數生物微粒分析與分選系統

COPASTM生物分選系統,這一目前市面上唯一的能夠分選40-1500um生物微粒的全自動、高通量分選系統,是由位于美國馬薩諸塞州的Union Biometrica公司出品。該公司作為Harvard Bioscience的子公司,專門致力于生物分選系統的研究、設計和制造。COPASTM系統可以檢測微粒的尺寸、光密度及熒光信號,并根據用戶設定的域值,將相應的微粒噴人96孔板或其它容器中,整個過程對于微粒的生物活性不會產生任何負面影響。

一、工作原理

COPASTM技術平臺是基于流式細胞技術開發的,但它與普通流式細胞技術相比,做了兩個重要的改進以適應大體積生物微粒分析與分選的需要。

第一,系統管路直徑增大以適應40-1500u m大小的生物微粒,這比普通流式細胞儀用于分選單個真核細胞的管路大的多。每一個COPASTM系統都針對不同尺寸范圍的微粒進行管路的優化設計,以便在高速高通量分選時獲得最好的檢測靈敏度與準確性。

第二,COPASTM技術的核心,即專利的氣流分選裝置(圖1、表1)。當不需要收集時,分選系統會通過氣體將液流吹人廢液槽中;當需要分選的微粒經過時,分選系統會暫時將氣體分流器關閉,使氣流中斷,然后再重新打開分流器,這樣就能將含有待選微粒的液流噴人微孔板或收集容器中。這種分選的方式非常溫和,可以保證收集到的生物活體或敏感化學物質的活性和完整性,對于后續的培養和分析不會產生任何負面影響,而普通流式細胞儀一般采用電磁場進行分選,會對生物活體產生致命的影響。

COPASTM生物分選系統可以同時檢測微粒的五種光學參數,包括微粒的光密度(Extinction,EXT)、微粒的軸向長度(Time Of Flight,TOF ),以及三色熒光信號(表1)。樣本懸液在鞘液的包裹下形成層流,生物微粒被聚焦在液流的中心輸送到流動室,通過兩個低能激光器來激發和檢測光信號。其中,一個紅色激光器( 670nm)被用來檢測微粒的軸向長度和光密度,而另一個多色氫激光器(488/514nm)被用來激發多種熒光素。儀器的標準配置包括綠光、黃光及紅光檢測器,用來檢測受激發的熒光素發出的光信號。這些實時檢測的參數被用來將樣本中的微粒分群,只有那些符合用戶設定域值的微粒才會被分選系統加人微孔板或樣品收集容器中,而那些不在用戶設定域值范圍內的微粒也可以被收集起來,以備后續的其它操作。最終的分選速度取決于樣本的濃度和需要分選的微粒所占的百分比,最快可以達到每小時100, 000個微粒。

二、應用領域

COPASTM多參數生物微粒分析與分選系統被廣泛應用在模式動植物研究、大體積細胞研究及藥物篩選等方面,具體應用對像包括微型模式動物:C .elegans、D .melanogaster、Zebrafish、Medaka, Mosquito, Xenopus;模式植物種子與花粉:Arabidopsis、花粉;大體積細胞與細胞簇:胚胎干細胞、胰島;微球/顆粒:化合物結合微球、微球分析。本文將重點介紹COPASTM生物分選系統在藥物篩選方面的新應用。

目前的高通量化合物篩選大多使用384或1536孔板。要提高分析的速度和通量并降低樣品消耗量就需要進一步增加板上孔的密度,但是對于目前的liquid handling技術而言,1536孔板已經接近其操作的極限。于是,另一種替代方法產生了,這就是基于微球的分析技術,On-bead assays(圖21} )。最近,一些科學家將COPASTM分選技術運用于On-bead assays中(圖3),大大提高了藥物篩選的效率,使篩選速度達到了每小時100000個化合物的高水平。同時,這種結合還大大節省了樣品的消耗量,同樣分析1000, 000個化合物,基于384孔板的方法以每孔20u1計算,大約需要20升的樣品和試劑,而運用COPASTM分選技術的On-bead assays只需要20-40m1的樣品。另外,COPASTM分選系統可以處理最大直徑達毫米級的微粒,這樣就完全可以分選500u m直徑的的微球,而這樣大小的微球可以滿足運用MS和NMR對單個微球進行結構分析的需要。





圖2. On-bead assays技術原理(A)與COPAS微球分選示意圖(B)

COPASTM生物分選系統可以運用到On-bead assays技術的多個領域(圖3),比如微球的質控,COPASTM可以分選出破損、塌陷和粘合的微球,從而保證用于實驗的微球的完整性;根據微球表面的熒光標記進行分選;從已經結合了化合物的微球中,去除那些結合了自發熒光化合物的微球,以避免假陽性。其中根據微球表面熒光信號進行分選是用途最廣的應用,現舉幾個例子進行說明。



圖3. COPASTM分選技術在On-bead assays中的應用(A),分選熒光微球時的散點圖(B)

(1)結合分析,動力學與竟爭分析(BindingAssays, kinetics and competition assays)

使用COPAS生物分選系統在以微球為載體的化合物庫中篩選能與帶有熒光標記的目標蛋白結合的化合物,將陽性化合物微球加人微孔板以進行后續的MS,NMR及其它分析,將沒有結合蛋白的陰性化合物微球加人收集容器以便重復使用。另外,還可以根據熒光信號的強弱設定域值,將陽性化合物微球進一步分為結合能力不同的幾群。目前,已經有科學家利用這種技術找到了一個能與纖維原細胞生長因子粘多糖結合位點結合的硫酸鹽化合物。



(2) On-bead酶一底物篩選(On-bead enzymesubstrate discovery)

將需要研究的多膚,如點突變多膚,兩端標記上淬滅熒光基團(FRAP ),然后連接到微球上,從而建立一個以微球為載體的多膚庫。將多膚微球與目的蛋白酶結合,如果蛋白酶能夠切斷多膚,就會發出熒光信號。由于使用COPAS高速分選技術,陽性微球可以被快速分選,以保證微球表面仍有足夠多的完整多膚以便進行后續分析。從建立多膚庫到陽性多膚序列分析的整個實驗流程,可以在一周內完成,與傳統方法相比效率提高了一百倍。丹麥的一個研究小組已經利用該技術研究了枯草桿菌蛋白酶的多膚底物結構。



(3)蛋白酶抑制劑篩選

COPAS技術的一個更為復雜的應用是在蛋白酶抑制劑篩選方面。首先,將帶有淬滅熒光基團(FRAP )的蛋白酶底物多膚連接在微球的一部分結合位點上,然后將需要篩選的抑制劑連接在微球的其它結合位點上,從而建立一個以微球為載體的抑制劑庫。將微球與蛋白酶一起孵育,如果抑制劑無效,蛋白酶會將多膚切斷,微球產生較強的熒光信號。如果抑制劑效果很強,蛋白酶無法切斷多膚,微球沒有熒光信號。如果抑制劑無法完全抑制蛋白酶活性,那么仍會有部分多膚被切斷,微球會發出較弱的熒光信號。這樣就可以利用COPAS技術根據微球熒光信號的強弱對微球進行分選,從而快速找到不同抑制強度的抑制劑。這種技術在篩選抑制劑和優化反應條件方面具有很高的效率和很大的靈活性,可以實現每小時100000個化合物的高速篩選。利用這種技術,荷蘭的一個研究小組在數周內找到了胰蛋白酶和多種基質金屬蛋白酶的多種抑制劑。



綜上所述,由于 COPASTM生物分選系統在微粒分選方面的強大功能,其與On-bead assays技術的結合必將成為藥物篩選的犀利武器,從而大大提高藥物篩選的效率,為人類健康作出貢獻。

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